Kombuchová historie 2: omyl s názvem kombucha

(toto je AI strojový překlad původního německého článku tištěného frakturou)

Biochemische Zeitschrift (1928)

Od Siegwarta Hermanna
Z farmakologicko-farmakognostického ústavu Německé univerzity v Praze.
(Přijato dne 17. listopadu 1927.)

O takzvané „Kombuše“, I.

V roce 1925 nám byla pod názvem „Kombucha“ předložena kultura mikroorganismů k posouzení a zkoumání. Literatura o ní nebyla k nalezení. Teprve po ukončení našich výzkumů referoval Henneberg² v kapitole „Teekwas“ o společenství hub, které má s kombuchou podobnost v tom, že se pěstuje analogickým způsobem. Bakteriologicky však Teekwas, jak později ukážeme, není s kombuchou totožný. Fyziologicko-chemické údaje nejsou uvedeny.

Obecně vychvalovaná účinnost nás vedla k tomu, abychom kulturní filtrát převedli do formy vhodné pro terapeutické zkoušky, která byla podrobena objektivní klinické zkoušce. Při klinickém vyšetření se ukázala celá řada objektivních nálezů snížení krevního tlaku. Zatímco o tom bude podána zvláštní zpráva, je zde tato skutečnost zmíněna pouze jako podnět k bližší analýze jednak příslušných mikroorganismů, jednak chemických procesů.

V následujícím je sdělen výsledek pokusů, které jsem provedl za účelem objasnění chemismu a flóry tohoto jako kombucha označovaného směsného houbového společenství.

¹ Čínské slovo „cha“ znamená čaj. Více o názvu se nepodařilo zjistit. Možná souvisí „Kombu“ s „Kombusi“ (lodní kuchyně). Není vyloučeno, že se kombucha může tvořit na starých zbytcích čaje. Z některých druhů čaje jsme mohli vypěstovat houby, které vyvolávají analogické kvašení. Dosud není zjištěno, zda se jedná o specifického parazita na čajovníku, nebo o náhodnou infekci.

² W. Henneberg, Handbuch der Gärungsbakteriologie, 2, 225, 1926, Berlín.

---

Nutnost zabývat se touto věcí byla dána také proto, že se již brzy po zahájení výzkumu ukázalo, že hlavní množství vznikající kyseliny není v žádném případě, jak bylo tvrzeno, kyselina mléčná¹, nýbrž, jak ukázaly mé analytické výzkumy a jak bude dále rozvedeno, zčásti kyselina octová, zčásti kyselina glukonová. Kyselina glukonová je sice známa jako produkt působení některých již známých druhů bakterií na hroznový cukr, avšak podle literatury se — až na jednu výjimku — tvoří jen v poměrně malém množství. Kombucha ji však vytváří ve velkém množství a koncentracích.

Právě tvorba kyseliny glukonové poskytla vodítko pro následující výzkumy tím, že byl stanoven úkol izolovat tu část houbového společenství, jíž se takzvaná kombucha ukázala být, která za určitých podmínek převádí přidaný cukr co nejúplněji na kyselinu glukonovou.

První část výzkumu byla provedena s nerozděleným houbovým materiálem tak, jak přišel do Prahy a jak byl zde na různých místech dále pěstován přeočkováním na slazený čajový nálev. Teprve ve druhé části mých výzkumů byla pomocí bakteriologických a mykologických metod provedena izolace zárodků a studována jejich účinnost.

Látka označovaná jako kombucha představuje v podstatě pevnou, silnou, slizkou blánu, která po naočkování do nálevu z čínského čaje, obohaceného třtinovým cukrem, roste. Obvykle se jedná o přídavek cukru takový, jaký se používá při běžné přípravě čaje ke konzumaci.

Pro své pokusy jsem zpravidla používal 7,5% roztoky cukru a 0,5% čajový nálev, tj. 5 g ruského čaje bylo přelito 1000 cm³ vroucí vody a po 5 minutách louhování zfiltrováno. Ve filtrátu bylo rozpuštěno 75 g třtinového cukru. Po ochlazení byl tento nálev naočkován kulturním materiálem, přičemž byl vždy použit kus zmíněné pevné houbové blány.

Ponechá-li se takový čajový nálev při pokojové teplotě, tedy obvykle při 20 až 22 °C, v nádobě pouze volně zakryté, vyvíjí se po různě dlouhé době, za vzniku kyselé reakce na lakmus, více či méně silná souvislá blána na povrchu, slizová vlákna v kapalině a malý sediment na dně.

¹ Srov. mimo jiné Dinslage a Ludorff, „Indická čajová houba“, Zeitschr. f. Unters. d. Lebensm. 58, 458, 1927.

---

Titrace této příjemně kyselé kapaliny ukázala během několika týdnů nárůst acidity. Okyselení brzy dosahuje takových stupňů, že konzumace kapaliny již není příjemná. Inkubace je proto ve většině případů, kdy je kombucha pěstována jako domácí prostředek, přerušena, jakmile se chuť kapaliny stane příliš kyselou. Vzniklá houbová vrstva se pak přenese na nový čajový nálev.

Předběžné vyšetření, které vedlo ke zjištění, že se jedná především o tvorbu kyseliny octové a kyseliny glukonové, bylo provedeno s nálevy z třtinového cukru, které byly naočkovány popsaným způsobem.

Nárůst kyselosti byl sledován denní titrací 20 cm³ kapaliny pomocí n/2 NaOH. Při tom byly v jednom náhodně vybraném pokusu zjištěny následující hodnoty kyselin v 20 cm³:
2. den 0,9 cm³ n/2,
5. den 3 cm³,
10. den 7,4 cm³,
15. den 12,3 cm³,
20. den 18 cm³,
25. den 24,8 cm³.

Obecně jsem nechával kvašení probíhat až do spotřeby 26 cm³ n/2 NaOH na 20 cm³ kapaliny.

Porovná-li se okyselená kapalina s původně neutrální, ukazuje se, že obsah tříslovin zůstává zdánlivě nezměněn (kolorimetrické srovnání roztoku po přídavku chloridu železitého). Rovněž se, jak vyplývá z experimentální části, obsah methylxanthinů téměř nemění. Kofein se nepatrně snižuje.

Kromě malého množství ostatních extraktivních látek čaje se tedy změna způsobená houbovou vegetací může vztahovat pouze na cukr. Čaj plní pouze funkci živného roztoku, resp. zdroje dusíku, a může být, jak bude ještě ukázáno, nahrazen i jinými živnými substráty, např. kvasničnou vodou nebo anorganickými živnými roztoky.

---

Při zkoumání kyselin jsem nejprve oddělil těkavé od netěkavých destilací ve vodní páře. Netěkavé kyseliny, které zůstaly v baňce, obsahovaly kromě extraktivních látek čaje ještě nevyčerpaný cukr.

Těkavá i netěkavá frakce byla zkoumána metodami blíže popsanými v experimentální části na kyseliny, které obvykle vznikají při kvašení sacharidů.

V těkavé frakci byla prokázána pouze kyselina octová. Ani kyselina mravenčí, ani vyšší mastné kyseliny nebyly přítomny.

Vyšetření zbytku na kyselinu mléčnou, šťavelovou, vinnou, citronovou, jantarovou a malonovou dalo negativní výsledky.

Přítomnost cukru, která rušila průběh analýzy, byla odstraněna tak, že destilační zbytek neutralizovaný zásadou byl podroben kvašení lisovanými kvasnicemi.

Použil-li jsem k neutralizaci místo hydroxidu sodného z důvodů daných analytickým postupem uhličitan vápenatý, přeměnil se filtrát po kvašení a odpaření na vodní lázni po několika hodinách v krystalickou hmotu květákovitého vzhledu.

Po opakované rekryystalizaci jsem mohl vzniklé krystaly v celku identifikovat jako vápenatou sůl d‑kyseliny glukonové.

---

Ukázalo se, že toto houbové společenství mění roztoky třtinového cukru v čaji tak, že po 5 týdnech je v průměru 60 % třtinového cukru přeměněno na kyselinu octovou a kyselinu glukonovou. V jednom náhodně vybraném příkladu poskytlo 10 g třtinového cukru 3,4 g kyseliny octové a 2,2 g kyseliny glukonové.

Při zkoumání chování jiných druhů cukrů a různých alkoholů se ukázalo, že tyto látky jsou částečně rozkládány za vzniku kyseliny octové nebo kyseliny glukonové, nebo obou, případně nejsou napadány vůbec. V některých případech docházelo k bujnému růstu houbové vrstvy, aniž by bylo možné prokázat změnu přidaných látek.

Chemicky čistý hroznový cukr je z větší části přeměňován na kyselinu glukonovou. V jednom příkladu spotřebovalo 20 cm³ kapaliny po 6 týdnech 10,7 cm³ n/2 NaOH. Z toho připadala asi třetina na kyselinu octovou.

Při použití technického hroznového cukru je však spotřeba titračního roztoku pro kyselinu octovou větší než pro netěkavé kyseliny. Vysvětlení, proč se kyselina glukonová a kyselina octová tvoří v proměnlivých množstvích, bude uvedeno v následujícím sdělení. Záleží také na tom, do jaké míry se rozvíjí jeden či druhý druh kvasinek nebo bakterií.

Z levulózy vzniká téměř výhradně kyselina octová. Podíl netěkavých kyselin je zanedbatelný. Kyselina glukonová nebyla v žádném případě prokázána.

Mléčný cukr se navzdory bohaté houbové vegetaci neokyseluje.

Z maltózy vzniká pouze malé množství kyseliny octové.

Z dextrinu vznikají při bohatém růstu houbové vrstvy malé množství těkavých i netěkavých kyselin.

---

Z těkavých kyselin bylo možné prokázat pouze kyselinu octovou. Identifikace byla provedena podle zápachu, pomocí kakodylové reakce, jako stříbrná sůl a jako ferriacetát.

Aby bylo možné prokázat případnou přítomnost kyseliny mravenčí nebo propionové, byl destilát nasycen chloridem vápenatým. Nedošlo k vyloučení olejovitých vyšších mastných kyselin. Také zkouška s oxidem olovnatým na bazický propionát olovnatý byla negativní. Pomocí sublimátu nebyla prokázána kyselina mravenčí.

Netěkavý podíl, resp. zbytek v baňce, byl po okyselení extrahován éterem, aniž by se — i při použití více destilačních zbytků — získala éterem rozpustná látka. Ani extrakce v Soxhletově aparatu nepřinesla výsledek. Tím byla prokázána nepřítomnost kyseliny mléčné.

Zbytek je s alkoholem mísitelný v jakémkoli poměru.

Protože reakce s kovovými solemi kvůli přítomnému cukru a extraktivním látkám čaje neposkytovaly použitelné vodítko, byl cukr odstraněn neutralizací hydroxidem sodným a následným kvašením lisovanými kvasnicemi. Filtrát vyčištěný živočišným uhlím byl zahuštěn a ošetřen octanem vápenatým a následně vápennou vodou až do silně alkalické reakce. Protože ani za studena, ani při varu nevznikla sraženina, bylo možné usoudit na nepřítomnost kyseliny šťavelové, vinné a citronové.

S chloridem železitým nevzniká v neutralizované kapalině sraženina. Lze tedy předpokládat, že není přítomna kyselina jantarová. Pyrrolová reakce je sice pozitivní, ale sotva pochází od kyseliny jantarové. I kdyby tomu tak bylo, mohlo by jít pouze o stopová množství.

Při přesně neutrální reakci poskytuje octan olovnatý bohatou sraženinu, která se v malém přebytku použité alkálie rozpouští. Navzdory této reakci lze usoudit na nepřítomnost kyseliny jablečné, neboť:

1. nevznikl hnědý ferrimalát,
2. ani při dlouhém varu roztoku kyseliny ošetřeného vápnem nedošlo k vyloučení špatně rozpustného kyselého malátu vápenatého.

Jedna zkouška s vápennou vodou vykázala následující den na okraji zkumavky malé bradavičnaté výrůstky, které se pod mikroskopem ukázaly jako jemné krystalické jehlice. Tato skutečnost vedla k pokusu o přípravu vápenaté soli.

Za tímto účelem bylo několik destilačních zbytků spojeno, neutralizováno uhličitanem vápenatým a podrobeno kvašení lisovanými kvasnicemi. Filtrát byl zahuštěn na malý objem. Po 48 hodinách se přeměnil v krystalickou hmotu květákovitého vzhledu.

---

Volná kyselina glukonová je jak ve vodě, tak v alkoholu zcela rozpustná a po zahuštění na vodní lázni tvoří sirupovitou, bezbarvou kapalinu. V éteru je nerozpustná.

Reakce s octanem olovnatým a zásaditým octanem olovnatým, pozorované při zkoumání okyseleného čaje, vykazuje i připravená kyselina glukonová.

Důkaz, že titrační hodnoty v netěkavé kyselinové frakci odpovídají obsahu kyseliny glukonové:

Roztok čaje s 10% třtinového cukru vykazoval po 6 týdnech po naočkování kombuchou pro 50 cm³ roztoku titrační hodnotu netěkavé kyseliny 11,4 cm³ n/2.

100 cm³ tohoto roztoku bylo zbaveno kyseliny octové destilací. Zbytek byl povařen s uhličitanem vápenatým, za horka filtrován, promyt, zahuštěn a přiveden ke krystalizaci alkoholem. Byla získána krystalická hmota.

S přihlédnutím k nečistotám a ztrátám při rekryystalizaci lze učinit závěr, že celá titrační hodnota netěkavé kyseliny odpovídá kyselině glukonové, zejména proto, že kvalitativně nebyla prokázána žádná jiná kyselina.

Plyny vznikající při kvašení byly zachycovány v aparatuře pro stanovení oxidu uhličitého. Došlo k výraznému vylučování uhličitanu barnatého. Na jiné plyny nebylo zkoumáno.

Stanovení alkoholu bylo provedeno destilací neutralizované kapaliny. Kvalitativní průkaz byl proveden pomocí dichromanu draselného a kyseliny sírové.

Obsah kofeinu se po okyselení jen nepatrně snižuje.

---

O takzvané „Kombuše“. II.

Bakteriologická analýza

Vzhled houbové vrstvy a vznikající octový zápach při kultivaci kombuchy vedly k domněnce, že tyčinkovité mikroorganismy přítomné ve vrstvě by mohly patřit mezi kožotvorné octové bakterie, pravděpodobně k druhu Bacterium xylinum.

Zejména ve starších vrstvách jsou uzavřeny kvasinky, které se v kultivačních nádobách hromadí i jako sediment. Bylo nasnadě považovat toto houbové společenství za odpovědné za okyselování roztoků třtinového cukru.

Henneberg sice kombuchu výslovně nezmiňuje, ale v kapitole „Teekwas“ popisuje japonskou nebo mandžuskou houbu, pro kterou uvádí stejné kultivační podmínky jako pro kombuchu. Předpokládá, že jde o náhodně vzniklé houbové společenství, které se šíří dalším přeočkováním. Podle něj se skládá z Bacterium xylinum a kvasinky typu Pombe.

Že se však v žádném případě nemůže jednat pouze o Bacterium xylinum a uvedenou štěpnou kvasinku, bylo zřejmé již na počátku mých výzkumů, protože množství vznikající kyseliny glukonové výrazně převyšovalo schopnost její tvorby u Bacterium xylinum.

Vznikl tedy úkol oddělit jednotlivé mikroorganismy kultury a porovnat jejich biologické vlastnosti s vlastnostmi celkové kultury, aby bylo možné izolovat původce látek, které by mohly být nositeli pozorovaného terapeutického účinku.

---

Jednotlivé kolonie z Petriho misek byly izolovány do čistých kultur a dále pěstovány i v kapalných médiích. Ukázalo se, že se jedná částečně o kvasinky a částečně o bakterie.

---

Bylo zjištěno, že kyselina glukonová vzniká pouze z hroznového cukru. Třtinový cukr a levulóza jsou všemi třemi bakteriálními kmeny okyselovány jen málo, zatímco maltóza a mléčný cukr nejsou okyselovány vůbec.

Třtinový cukr je některými kmeny invertován. Hroznový cukr je všemi třemi kmeny oxidován na kyselinu glukonovou, přičemž nejvýrazněji tento proces probíhá u kmene D.

Jiné netěkavé kyseliny nebyly pomocí použitých analytických metod prokázány.

Pokusy provedené s referenčními kmeny ukázaly, že dva z izolovaných kmenů odpovídají známým druhům (Bacterium xylinoides a Bacterium xylinum).

---

Kmen D oxiduje ethylalkohol na kyselinu octovou, a lze jej tedy zařadit mezi octové bakterie. Podle zjištěných vlastností však neodpovídá žádnému druhu popsanému v literatuře.

Kmen D je tedy původcem tvorby kyseliny glukonové v kombuše.

---

Ve srovnání s dosud známými bakteriemi tvořícími kyselinu glukonovou se kmen D vyznačuje odlišným fyziologickým chováním, zejména tím, že není schopen okyselovat maltózu, mléčný cukr ani mannitol.

Dále se liší schopností okyselovat roztoky s velmi vysokou koncentrací glukózy.

Ostatní známé bakterie tvořící kyselinu glukonovou produkují ve srovnání s tímto kmenem pouze minimální množství této kyseliny a vykazují i další morfologické a fyziologické rozdíly.

Z toho vyplývá, že se liší tím, že na rozdíl od obou uvedených bakterií není schopen okyselovat ani maltózu, ani mléčný cukr, ani mannitol. Výrazná přeměna maltózy na kyselinu pomocí Bacterium industrium a Bacterium oxydans je v literatuře¹ pro tyto dva druhy uváděna jako charakteristická. Maltóza je Bacterium industrium během 14 dnů okyselena natolik, že 50 cm³ kapaliny spotřebuje 18 cm³ n/2 louhu; Bacterium oxydans okyseluje maltózu během 20 dnů tak, že 50 cm³ kapaliny spotřebuje 23 cm³ n/2 louhu, zatímco kmen D maltózu neokyseluje vůbec.

Roztoky dextrinu se působením Bacterium industrium stávají vláknitými a při 30 °C tuhnou. Kmen D je z fyzikálního hlediska vůbec nemění. U Bacterium oxydans leží hranice okyselování při 35% roztoku dextrózy, zatímco u kmene D dochází k okyselování ještě i v 50% roztoku dextrózy. K těmto rozdílům přistupuje ještě řada dalších, které se týkají tvorby blány a vzniku hypertrofických buněk.

Ostatní bakterie kyseliny octové tvořící kyselinu glukonovou produkují, jak vyplývá z literatury, ve srovnání s kmenem D pouze minimální množství kyseliny glukonové. Kromě toho vykazují, jak je patrné z uvedené tabulky, značné kvalitativní rozdíly, pokud jde o tvorbu kyselin vůbec. Nakonec jsou v uvedené literatuře popsány i výrazné morfologické rozdíly oproti kmenu D.

Z toho vyplývá, že bakterie izolovaná mnou z kombuchy není totožná s žádnou dosud popsanou. Jedná se tedy o nový, dosud zcela neznámý druh bakterie, který navrhuji označit jako Bacterium gluconicum².

Shrnutí

Kombucha představuje houbové společenství, v němž se vedle kvasinek a Bacterium xylinum a Bacterium xylinoides vyskytuje dosud neznámá bakterie, která kvantitativně převádí hroznový cukr na kyselinu glukonovou. Tuto bakterii označujeme jako Bacterium gluconicum. V důsledku přítomnosti kvasinek je třtinový cukr v kombuše rychle štěpen, takže z vzniklého invertního cukru může být pomocí Bacterium gluconicum tvořeno velké množství kyseliny glukonové. Alkohol vznikající částečným kvašením třtinového cukru je všemi přítomnými bakteriemi oxidován na kyselinu octovou. Nabízí se souvislost mezi pozorovaným terapeutickým účinkem kombuchy a tvorbou kyseliny glukonové, resp. s bakteriemi Bacterium gluconicum.

¹ Henneberg, Handbuch der Gärungsbakteriologie, 2, 195, 197, 1926.
² Pro úplnost je třeba upozornit, že vláknité houby, zejména rody Aspergillus, mohou rovněž přicházet v úvahu při tvorbě kyseliny glukonové. Při našich pokusech bylo ovšem dbáno na jejich úplnou nepřítomnost.

---

Podle dosavadních klinických pokusů se zdá, že čistě izolovaná kyselina glukonová získaná z kulturních tekutin se přímo nepodílí na terapeutickém účinku kombuchy. Je však možné, že právě zde přítomná bakterie tvořící kyselinu glukonovou při svém růstu vede ke vzniku látek, které představují vlastní terapeuticky účinné činidlo. Analogicky k jiným poznatkům by bylo možné uvažovat o látkách vitamínového charakteru. Tvorba kyseliny glukonové by pak byla pouze indikátorem přítomnosti a aktivity těchto mikroorganismů¹.

¹ Aby bylo možné provádět farmakologické a klinické pokusy ve větším měřítku, vyrábějí Farmaceutické závody „Norgine“, a. s., Praha – Ústí nad Labem podle našeho postupu přípravek získaný z kultur inkubovaných do určitého stupně acidity, který má ve sterilní a trvanlivé formě vždy stejné složení.